一、精子的制动

精子在制动剂PVP内游动的速度大大减缓，易于被注射针制动和捕获。操作时通过微调操纵杆将注射针抬起，然后放下操纵杆轻轻压住选好的精子尾部，随后瞬间移动操作杆控制注射针尖从精子尾部快速擦过，以实现精子被制动。

精子制动的意义:一方面，精子制动后便于注射针捕获精子；另一方面，精子尾部被注射针摩擦受损后，精子内部的细胞因子(精子因子)释放到卵母细胞中与卵胞质中的卵子因子结合，形成复合体启动休眠的卵母细胞被激活。

此外，精子膜受损后，渗透性增加，加速顶体下核周鞘分解，促进精子核解聚及雄原核形成。核周鞘是介于精子核膜与顶体内膜之间的一层特殊的骨架蛋白，在精子发生过程中对指导精子变形、保护精子DNA发挥重要作用。

如果ICSI过程核周鞘不能分解，则阻碍精核浓缩，精核浓缩不完全直接影响原核DNA的复制及父系基因的表达。精子制动过程中禁止触及精子头部和颈部，避免损伤精子DNA和中心粒。精子DNA和中心粒受损，一方面会影响受精和原核形成，另一方面将影响后续胚胎的发育及优质胚胎的形成。

二、卵母细胞控制

(一)置卵

双人核对姓名后，将卵母细胞置于PVP周围的配子体外操作用培养液微滴中。

(二)卵母细胞的控制

用持卵针通过负压固定住卵母细胞，为避免损伤卵母细胞的遗传物质，常常将卵母细胞的第一极体位于12点或6点钟位置。

三、显微注射操作

通过微调调整操作杆，使极体、透明带及注射针处于同一平面。注射针针尖位于卵母细胞的3点钟位置，使针尖轻轻抵在透明带边缘，将精子吹吐至针尖部位,然后稍微回吸注射器,使注射针针管内压力保持平衡以固定针尖部的精子，然后轻轻将注射针刺入卵母细胞，针尖位置到达卵母细胞中部后开始缓慢回吸胞质，直到吸破胞质膜,当镜下观察到胞质回流入针管后，则迅速将回吸的卵胞质和精子一起吹吐回胞质内，精子进入胞质后应快速拔出注射针,避免将PVP或培养液注射入卵母细胞，随后松开持卵针释放卵母细胞，观察注射的卵母细胞膜和胞质恢复情况，观察注射部位是否有胞质溢出。射注后的卵母细胞应迅速移入胚胎卵裂期培养液并置于37℃、5%或6%CO2培养箱内行胚胎体外培养。ICSI过程中核对人员应协助记录卵母细胞、精子及显微穿刺情况。

注意：ICSI过程中，回吸胞质可人为引起钙震荡，有助于机械激活卵母细胞，但胞质抽吸过于猛烈，可能会损伤卵子内部结构，引发细胞内超微结构或纺锤体损伤，因此，操作人员需经过严格培训后方可进行ICSI操作。显微注射可引起卵母细胞退化死亡，发生率约为7%~14%，积累操作经验至关重要，丰富的操作经验可适当降低卵母细胞坏损率。当然，并不是所有损伤都与操作有关，若卵母细胞不成熟，则卵胞膜脆性大，ICSI后，卵胞膜不能很快恢复。胞质易从针刺口溢出，导致卵母细胞死亡；若卵母细胞老化，则细胞膜韧性增加，不易被刺破，ICSI时注射力加大也容易导致卵子损伤。

四、ICSI后卵母细胞培养和受精观察

ICSI后的卵母细胞经胚胎分裂期培养液充分洗涤后，移入分裂期培养液，随后培养皿置于37℃、5%或6%CO2培养箱内行胚胎体外培养，次日观察并记录受精情况后继续行胚胎体外培养。

ICSI后16~18小时，倒置显微镜下观察卵母细胞内是否存在双原核( two pronuclear，2PN)双原核存在表明卵母细胞成功受精；原核内含有数个核仁( nucleolus)，是rRNA前体合成的场所，所以被称为核仁前体( nucleolar precursor bodies,NPB)研究表明：NPB的数量、大小、分布与卵裂、优质胚胎率、妊娠率及胚胎着床率相关。

ICSI后,若卵母细胞显示3PN,可能与卵母细胞第二极体排出异常有关，也可能注射了2倍体异常精子等因素；若卵母细胞呈现1PN，可能与卵母细胞孤雌激活、原核形成不同步、原核融合有关;若观察时未看到原核形成(之为OPN)，但次日却发生卵裂，可能与原核发育延迟或原核已经消失有关。

卵母细胞自身异常，如纺锤体异常或胞质缺陷，可导致原核形成失败或激活失败进而造成卵母细胞不能成功受精；也有精子因素导致的受精失败，如圆头精子或小顶体精子等，这些都是精子因素引起的激活失败而导致的卵母细胞不受精。对于反复ICSI受精完全失败的病例，通过化学方法行人工辅助激活可能对个别特殊患者有一定的帮助。